参考文献/References:
[1].方法16。4℃,pH8条件下,海藻酸钠上的羟基和甲基丙烯酸酐发生酯化反应,透析后冷冻干燥得到甲基丙烯酸接枝率为50%的甲基丙烯酸化海藻酸钠(MAA)。配制3 wt%的MAA/TEOA(含0.5% I2959)溶液,按质量比为RGD:MAA=0.385:1加入RGD多肽(GCGYGRGDSPG),室温下反应1h后,加入与MAA等体积的明胶微球,混合均匀后加入到模具中,7.9 mW/cm2紫外光照下交联得到粘附型的大孔海藻酸钠水凝胶。
[2].1.4 凝胶性能测试
[3].采用电子万能材料试验机(Shenzhen SANS Testing Machine)测试了凝胶的压缩强度和压缩模量,传感器为200N,试样为8mm×2mm 的圆柱形,加载速度为0.3 mm/min,每组试样平行测五次。将凝胶化 24h 的试样按 0.1g/mL 加入PBS中浸泡,通过测定其质量随时间变化规律考察各组凝胶在PBS中的溶胀率。溶胀率计算公式如下: S=(w-w0)/w0×100%,其中 S为溶胀率, w为材料吸水后的质量, w0 为凝胶的初始质量.
[4].1.5 MG-63细胞—海藻酸钠凝胶体外培养
[5].将MG-63 细胞悬液按1×107 cells/mL密度分别接种于凝胶前溶液中,溶液固化成凝胶后加入DMEM培养基,置37℃, 5% CO2 培养箱内培养。
[6].体外培养1,3,5天后,加入0.5mg/ml MTT, 37℃孵育4 h后加入DMSO振荡, 酶联免疫检测仪在490 nm波长测定吸光度(optical density, OD)。
[7].通过FDA/PI染色,激光共聚焦显微镜观察MG-63细胞在凝胶内的形态和分布。
[8].采用ALP试剂盒(Sensolyte pNPP Alkaline Phosphatase Assay Kit, AnaSpec)检测细胞内碱性磷酸酶(ALP)的活性。
[9].荧光定量PCR检测成骨相关基因的表达:将载有细胞的凝胶经液氮速冻研磨后,用TRIZOL常规提取总RNA,经逆转录试剂盒(Bio-Rad, USA)反转录成cDNA。RT-qPCR在六色梯度实时定量PCR仪(Bio-Rad, CFX960, USA)上进行,试剂盒为SsoFastTM EvaGreen Supermix (Bio-Rad, USA)。实验选择骨形态发生蛋白-2(BMP-2),I型胶原(COL-I),骨钙素(OCN)和GAPDH基因,其引物序列见表1。BMP-2,COL-I,OCN和GAPDH mRNA的表达水平表示为阈值(CT),用2△△Ct值法来计算相对表达量,看家基因GAPDH的表达作为内参来归一化结果,所有样品分析三次。